TERAPIA CELULAR O GENICA EN LA DM TIPO 1

La terapia génica consiste en introducir genes en un organismo con el objetivo de corregir algún tipo de patología.

Actualmente, las aproximaciones empleadas para la terapia

génica de la DM se centran en cuatro áreas:

1. Terapia celular por medio del trasplante de células modificadas genéticamente para que expresen insulina de manera regulada, obteniéndose células beta artificiales. Así, en pacientes con DM tipo 1 podrían trasplantarse células secretoras de insulina derivadas de células beta o bien derivadas de distintas líneas celulares no endócrinas, como hepatocitos, mioblastos o fibroblastos, manipuladas genéticamente para que produzcan insulina humana

 

2. Reducción de la hiperglucemia mediante un incremento

en la captación de la glucosa por el hígado y/o los tejidos periféricos gracias a la inducción de la enzima glucocinasa (enzima clave en la regulación de la utilización de glucosa).

3. Prevención de ataques autoinmunes desarrollando mecanismos de prevención para las células beta, con lo que podrían preservarse tanto los islotes trasplantados como los propios de los individuos prediabéticos.

4. Inducción de la regeneración de las células beta mediante la alteración de la expresión de genes en determinados tipos celulares o la inducción del aumento de dichas células a partir de las ya existentes introduciendo factores de transcripción que determinen su formación y/o proliferación.

 

INVESTIGADORES DE LA UAB CURAN DIABETES TIPO 1 EN PERROS

 

En este caso de Diabetes Mellitus tipo 1 se han usado como vectores los virus adeno-asociados que actúan como un taxista que en este caso ha sido programado para localizar las células musculares e introducirse en ellas. Una vez se han introducido depositan el material genético que portan, en este caso se introducen los genes de la glucoquinasa y la insulina que son expresados como cualquier otro gen de la célula.

Cuando estos genes actúan de forma simultanea las células funcionan como sensores de glucosa que permiten regular la glucosa en sangre con la producción de la insulina. En este caso el tratamiento se realiza con un simple pinchazo en el músculo de las patas traseras y, tal y como pensamos, estos músculos , con la inclusión de estos genes, cumplen la función del páncreas, regulando la cantidad de glucosa a niveles normales.
 

 Sin duda se trata de un avance muy importante ya que si no se reportan efectos secundarios es muy probable que en pocos años sea una terapia ampliamente aplicada a los diabéticos de tipo I, olvidándose de pinchazos de insulina, y de medir los niveles de glucosa.



 
 

ADN RECOMBINANTE EN DIABETES

Las hormonas como la insulina o la hormona de crecimiento humanas, son creadas en cuerpos que funcionan normalmente. Estas hormonas son proteínas y las proteínas están hechas de una secuencia específica de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos está determinada por el ADN de una persona. Anteriormente, los diabéticos usaban insulina porcina, pero no era bien tolerada por todos los pacientes ya que su secuencia de aminoácidos es levemente diferente. Hoy en día, los científicos han desarrollado bacterias que poseen el gen humano para la insulina que se ha insertado dentro de ellas utilizando técnicas de ADN recombinante. Como la secuencia de aminoácidos es la misma, los diabéticos la toleran rápidamente aún cuando ha sido producida por una bacteria.

Existen dos rutas de producción de insulina humana utilizando microorganismos modificados por ingeniería genética. Una de ellas consisten en obtener por separado ambas cadenas para posteriormente asociarlas químicamente. La otra se basa en la producción de proinsulina que es procesada hasta insulina humana madura mediante métodos enzimáticos.

Este tipo de manipulación de material genético incluye varios pasos:
1.- obtención por síntesis química del gen deseado
2.- Aislamiento de gen en un vehículo de transporte tal que le permita una expresión eficiente y estable en el organismo receptor.
3.- introducción del gen en el organismo receptor mediante el vehículo en este caso; en este caso se utilizó la bacteria Escherichia coli.

ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA

La recombinación genética es un proceso biológico que se produce normalmente en todos los organismos, tras el cual se produce un cambio del genoma (patrimonio genético del que está dotado un organismo) y se verifica normalmente con la rotura y la reunión del ADN. Hoy es posible crear moléculas recombinantes entre segmentos de ADN que no presentan homología y que pueden proceder de organismos diversos. Con el uso coordinado de las enzimas de restricción y de los vectores moleculares, es posible aislar una secuencia de ADN de cualquier organismo e inserirla en el ADN de otro. Las formas vivas que han sufrido tal transformación y que contienen un ADN extraño son llamadas transgénicas.

Existen varios tipos de recombinación genética, en las células eucariotas

 

Recombinación homóloga

La recombinación homologa (también llamada recombinación general) sucede durante la profase I de la meiosis y tiene lugar entre las largas regiones de ADN cuyas secuencias son homólogas, es decir altamente similares pero no idénticas..

A lo largo de los últimos 100 años, el conocimiento de la genética ha crecido exponencialmente. Hoy en día, los científicos se han visto beneficiados con los años de investigación y están explorando con éxito el campo de la ingeniería genética. Combinando el ADN de dos organismos distintos con la técnica del ADN recombinante, son posibles muchos resultados, y el potencial de esta ciencia es virtualmente ilimitado. Los usos del ADN recombinante varían ampliamente; se emplea en muchas industrias diferentes, desde la medicina hasta la agricultura

 

El primer pez que brilla en la oscuridad, el TK-1:

Se trata en realidad del medaka japonés (Oryzias latipes), un pequeño pez de agua dulce con una alta transparencia en su cuerpo

• Al pez en cuestión se le injertó un gen de medusa que produce fluorescencia en los animales que lo poseen. Lo lograron mediante el uso de un plásmido como vector, el pGLO, que incluye el gen que codifica la GFP (Green Fluorescence Protein).

• Al tener ahora el gen GFP, producían en su cuerpo la proteína fluorescente.

• A este pez no tardaron en seguirle el TK-2, TK-3, y el TK-4, 

 

Aplicabilidad clínica de las tècnicas moleculares en Diabetes tipo 1

El advenimiento de las técnicas moleculares ha permitido estudiar al nivel alélico, el sistema mayor de histocompatibilidad (mayor histocompability complex -MHC) presente en el individuo, dejando constancia de su amplio polimorfismo.

Las técnicas moleculares más empleadas tienen un principio común: la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction -PCR). Como ejemplo de técnicas moleculares aplicadas al genotipaje HLA podemos mencionar: PCR-SSO y PCR-SSP. La primera se basa en la amplificación de la zona polimórfica del ADN por PCR y la hibridación con oligonucleótidos de secuencia específica (SSO) que se encuentran asociados a las membranas de nylon. La segunda emplea cebadores de secuencia específica (SSP) que detectan alelos específicos del HLA.³²

La técnica de PCR en tiempo real (real time PCR)  es una variante de la PCR que permite amplificar y cuantificar simultáneamente el producto de la reacción mediante el empleo de un fluoróforo. Esta sustancia, al ser excitada, permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos mediante sensores de fluorescencia ubicados en el termociclador luego de cada ciclo de amplificación.

En el caso de las técnicas moleculares, el tipo de célula, la viabilidad celular y la expresión del antígeno sobre su superficie no son importantes. Los cebadores utilizados en esta metodología son fácilmente diseñados. Esta tecnología ofrece mayor confiabilidad, exactitud y flexibilidad de resolución.

OTRAS TECNICAS MOLECULARES EN DM TIPO 1

Actualmente, la búsqueda de genes candidatos está dirigida hacia el descubrimiento de nuevas regiones génicas de susceptibilidad a DM1. En este sentido, se han identificado dos regiones que son objeto de amplias investigaciones

 

Durante los últimos años la búsqueda de genes implicados en el riesgo de desarrollar diabetes tipo I (insulino- dependiente) ha apuntado a la zona del HLA de clase II(IDDM1)  en el cromosoma 6q21.3 ( IDDM2) como principal región implicada en la susceptibilidad a la enfermedad. Así mismo, se ha demostrado la relación de la región polimórfica de repeticiones en tándem en numero variable (Variable Number of Tandem Repeats:VNTR)situada en el extremo 5’ del gen de la insulina en el cromosoma 11p15.5 (IDDM2) con la enfermedad en diferentes poblaciones caucásicas y no caucásicas.

 

Mediante análisis por Southern Blot, se ha observado que los alelos VNTR de menor tamaño [clase I; longitud media: 570 pares de bases (pb)] son más frecuentes entre los pacientes con diabetes tipo I, mientras que los de mayor tamaño (clase III; tamaño medio: 2.200 pb) son, preferentemente, protectores.
 
Existen también alelos de tamaño intermedio (clase II; tamaño medio:1.200 pb), pero son raros en las poblaciones caucásicas. Más recientemente, se ha desarrollado una técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa para el subtipado de los alelos de clase I, permitiendo estudiar los efectos alelo-específicos sobre la susceptibilidad a la enfermedad.

 

 

BIBLIOGRAFIA

http://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S0025-76802004000600011&script=sci_arttext
 http://course.zjnu.cn/molbio/img/dna-southern-blot-hybridiza.gif

 

 

 

DIABETES TIPO 1 Y PCR

El trabajo realizado por los investigadores alrededor del orbe ha permitido entender mejor a la DM en lo que respecta a la

etiología, mecanismos fisiopatológicos y la aproximación diagnóstica y terapéutica. Con el impresionante desarrollo de la
biología molecular en las últimas décadas, el panorama del conocimiento cambio radicalmente. El diagnóstico molecular
se lleva a cabo por medio de la PCR, empleando ADN extraído del paciente, posteriormente, se amplifica el gen
candidato empleando iniciadores (primers) especificos de este gen, el cual se le considera un marcador molecular.


Un marcador molecular se define como un gen o una proteína que presenta ciertas características como: a) participa solo en una vía de señalización, b) presenta polimorfismos o c) variantes génicas se expresan en cierta condición o enfermedad, solo por mencionar algunas características. Por ejemplo, se logro identificar genes/proteínas que participan tanto en la  secreción de insulina en respuesta a una concentración de glucosa plasmática, como en la vía de señalización

intracelular para la acción de esta hormona, por lo que cada uno de esos genes pudiera ser un gen candidato para considerarlo como un marcador molecular.

ARTICULO RELACIONADO: Asociación del locus IDDM2 (región polimórfica de repeticiones en tamdem en numero variable situada en el extremo 5 del gen de la insulina 11p15.5) en la población española con diabetes tipo 1.
Objetivo: Amplificar el locus IDDM2 en familias españolas con diabetes tipo1  y su asociación con el  riesgo de desarrollar diabetes tipo 1.

Muestra: sangre periférica

ADN: genómico

PCR: Nested

El gen de la insulina fue amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa con los oligonucleótidos 5FP1 y 5FP2 que flanquean la región VNTR.

Los productos obtenidos se separaron por electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 3,5% y se detectaron mediante tinción con plata.

En función del tamaño obtenido, los alelos se clasificaron en clases I o III. Para subtipar los alelos de clase I las muestras de ADN fueron amplificadas con los oligonucleótidos VNTR5 y VNTR6

La electroforesis se llevó a cabo en geles de poliacrilamida desnaturalizante al 6% en un secuenciador automático ALFexpress.
CONCLUSIONES:  el estudio de el locus IDDM2 en la población española permitió observar que el genotipo homozigoto clase I/I asociado con el doble riesgo a desarrollar diabetes tipo 1, es menor al observado en otras poblaciones, lo cual podría ser explicado por la alta prevalencia en la población general de España de alelos clase I que no predisponen la enfermedad

DIABETES TIPO 1- DIAGNOSTICO

   

   

 La diabetes mellitus (DM) es un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por :

Hiperglucemia secundaria a un defecto absoluto o relativo en la secreción de insulina, que se acompaña, en mayor o menor medida, de alteraciones en el metabolismo de los lípidos y de las proteínas, lo que conlleva una afectación microvascular y macrovascular que afecta a diferentes órganos como ojos, riñón, nervios, corazón y vasos.

 

En la clasificación actual, la DM1 se subdivide en dos subtipos:

      DM1 A o autoinmune: enfermedad autoinmune en la que existe una destrucción selectiva de las células del páncreas mediada por linfocitos T activados en sujetos con haplotipos HLA de predisposición.

     DM1 B o idiopática: engloba a aquellos pacientes con mismas o iguales características, en los    que no se encuentran datos de autoinmunidad ni haplotipos HLA de predisposición.

En 90% de los pacientes se detectan anticuerpos anti-islotes(ICA), anti-decarboxilasa del ácido glutámico (antiGAD), anti-insulina (IAA) y transmembrana tirosin-fosfatasa (IA-2); 10% de los casos son considerados idiopáticos y no presentan marcadores serológicos de autoinmunidad.

 



ALGORITMO DIAGNOSTICO
 

La DM tipo A o autoinmune se relaciona con la destrucción de las células B del islote de Langerhans pancreatico, generalmente como consecuencia de una respuesta autoinmune contra determinadas moléculas del islote: insulina, glutamato- descarboxilasa, tirosian- fosfatasa (IA-2), carboxipeptidasa H; ICA 69, etc.

Los autoanticuerpos contra estos antígenos pueden ser detectados en el suero de pacientes con DM1, y esto ha sido utilizado como una ayuda en el diagnóstico, en la clasificación y en la predicción de la enfermedad.

 

Los autoanticuerpos pueden ser detectados incluso durante la fase prodrómica, como en el caso de la DM1 tipo A, durante la cual aunque todavía no se den síntomas clínicos se está llevando a cabo una destrucción de las células

β. Además es posible usar estos autoanticuerpos como marcadores de actividad de enfermedad, y su medición pueden ayudar a definir la naturaleza de la diabetes, proporcionando marcadores para clasificarla en autoinmune o no, según la presencia o ausencia de anticuerpos asociados a la enfermedad.

 

 

Mecanismos Genéticos se vinculan a la diabetes tipo 1

Las personas desarrollan diabetes tipo 1 cuando su sistema inmune busca y destruye las células ß del páncreas, productoras de insulina. La interacción de los factores medioambientales con una serie de variantes genéticas tiene como resultado la alteración del sistema inmune, que provoca la afección. Tony Merriman nos habla de los enfoques que se utilizan para identificar los genes que hacen que una persona sea susceptible de desarrollar diabetes tipo 1. 

  Genes implicados:

1.- Genes del MHC

         a.- DR3 y DR4  tienen un riesgo entre 10 y 20 veces superior de desarrollar la afección.
          b.- Variante DR2, tienen una fuerte protección ante la diabetes tipo 1:

•Aparece en un 1% de los niños con DM1

•La protección conferida por el haplotipo parece ser dominante.

•El efecto de este alelo podría ser menos potente en poblaciones no caucásicas, como en la raza negra y en la raza hispana.

•Probablemente existan otros alelos HLA que ofrezcan protección frente a DM1. Sin embargo, su baja frecuencia en la población general dificulta su estudio, ya que son necesarios tamaños muestrales grandes para analizar su efecto.

 2-  gen de la insulina personas con más repeticiones están más predispuestas a desarrollar diabetes tipo 1:

 

El locus IDDM2 incluye un número variable de repeticiones entándem (variable number of tandem repeats, VNTR) en el cromosoma 11p15, en el minisatelite 5’ del gen de la insulina.

Los polimorfismos en esta región no codificante del gen de la insulina están asociados con riesgo de DM1.
•Existen tres tipos principales de VNTR de insulina.

Clase I (26-63 repeticiones),clase II (aproximadamente 80 repeticiones),clase III (140-200 repeticiones).
•Estos polimorfismos influyen en la cantidad de ARN mensajero de insulina detectable en el timo, lo que podría constituir la base fisiopatogénica de su influencia sobre el riesgo de DM1.

        Los alelos VNTR de clase III están asociados con mayor expresión de ARN mensajero de insulina en el timo, y la transcripción de insulina en el timo se correlaciona de forma inversa con susceptibilidad para diabetes autoinmune, tanto en humanos como en modelos animales transgénicos

3- Tipo de actividad de los linfocitos T es el eje de enfermedades autoinmunes (autolesiones) como la diabetes tipo 1, por lo tanto que tenga un efecto critico sobre los linfocitos T afectara a dichas enfermedades.

4- Gen CTLA- 4  en el en el cromosoma 2q33,como gen que determina la susceptibilidad de desarrollar diabetes.

•El gen CTLA-4 es un candidato fuerte, debido a que su producto proteico está involucrado en el control de la actividad de los linfocitos T.

•Las variantes del CTLA-4 ya habían sido asociadas previamente, si bien de manera inconsistente, a la diabetes tipo 1, en una serie de poblaciones.

•Las múltiples variaciones descritas entre poblaciones limitan la utilidad de este locus.